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Apr 03, 2024

Diagnose der Urogenitaltuberkulose: Nachweis von mykobakteriellem Lipoarabinomannan und MPT

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11560 (2023) Diesen Artikel zitieren 405 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Wir haben einen Cocktail aus Mycobacterium tuberculosis lipoarabinomannan (LAM) entdeckt und

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 11560 (2023) Diesen Artikel zitieren

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1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Wir haben einen Cocktail aus Mycobacterium tuberculosis lipoarabinomannan (LAM) und MPT-64-Biomarkern in extrazellulären Urinvesikeln (EVs) von Patienten mit urogenitaler Tuberkulose (GUTB) durch einen nanobasierten Immuno-PCR (I-PCR)-Assay, d. h. gekoppelt mit magnetischen Kügelchen, entdeckt Goldnanopartikel-basierte I-PCR (MB-AuNP-I-PCR) und verglich die Ergebnisse mit I-PCR und Magneto-ELISA. Die Größe(n) der Urin-EVs lag(n) zwischen 52,6 und 220,4 nm, wie durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Nanopartikel-Tracking-Analyse analysiert. Funktionalisierte AuNPs (gekoppelt mit Detektionsantikörpern/Oligonukleotiden) wurden durch UV-Vis-Spektroskopie, TEM, ELISA, PCR, Rasterkraftmikroskopie und Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie charakterisiert, während die Konjugation von Einfangantikörpern mit MBs durch UV-Vis-Spektroskopie und Magneto-Vis-Spektroskopie validiert wurde. ELISA. Unsere MB-AuNP-I-PCR zeigte Sensitivitäten von 85 % bzw. 87,2 % bei klinisch vermuteten (n = 40) und insgesamt (n = 47) GUTB-Fällen, mit einer Spezifität von 97,1 % bei Nicht-TB-Kontrollen (n = 35). . Diese Ergebnisse wurden durch die quantitative SYBR Green MB-AuNP-Echtzeit-I-PCR (MB-AuNP-RT-I-PCR) weiter authentifiziert. Gleichzeitig zeigten I-PCR und Magneto-ELISA Sensitivitäten von 68,1 % bzw. 61,7 % in allen GUTB-Fällen, die deutlich niedriger waren (p < 0,05–0,01) als MB-AuNP-I-PCR. Bemerkenswerterweise wurde ein großer Bereich (400 fg/ml–11 ng/ml) von LAM+MPT-64 in den Urin-EVs von GUTB-Fällen durch SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR quantifiziert, was die Krankheitsdynamik beurteilen kann. Diese Studie wird sicherlich die aktuellen Algorithmen der GUTB-Diagnostik verbessern.

Vor der COVID-19-Pandemie war Tuberkulose (TB) die häufigste Todesursache durch einen einzelnen Infektionserreger und rangierte noch vor HIV/AIDS. Heute ist Tuberkulose nach COVID-191 die zweitgrößte Todesursache in Bezug auf Infektionskrankheiten. Im Jahr 2021 wurden etwa 1,4 Millionen bzw. 0,19 Millionen Todesfälle bei HIV-negativen und HIV-positiven TB-infizierten Personen gemeldet1. Die COVID-19-Pandemie hatte negative Auswirkungen auf den Zugang zu Tuberkulosediagnose und -behandlung sowie auf die gesamte Tuberkulosebelastung1. Im Jahr 2021 verzeichnete Indien die höchste TB-Belastung (28 %), gefolgt von Indonesien (9,2 %) und China (7,4 %).1. Urogenitale Tuberkulose (GUTB) ist die am zweithäufigsten gemeldete Form der extrapulmonalen Tuberkulose (EPTB) in Entwicklungsländern wie Indien und die dritte weit verbreitete Form in Ländern mit geringer Endemie2. Das ungewöhnliche klinische Erscheinungsbild, die Lokalisierung der Erkrankung an verschiedenen anatomischen Stellen und die paucibacilläre Beschaffenheit der Proben machen die Diagnose männlicher/weiblicher GUTB zu einer großen Herausforderung. Um die mit GUTB verbundene Morbidität/Mortalität zu reduzieren, ist eine sofortige und präzise Diagnose erforderlich. In Entwicklungsländern ist die Abstrichmikroskopie weit verbreitet, ihr mangelt es jedoch sowohl an Empfindlichkeit als auch an Reproduzierbarkeit3. Obwohl die kulturelle Identifizierung von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) anhand von Endometriumbiopsien (EBs)/Urinproben von GUTB-Fällen als Gold-/Referenzstandard gilt, weist sie aufgrund der geringen Bakterienbelastung im Lowenstein-Jensen-Medium (LJ) im Allgemeinen eine geringe Empfindlichkeit auf sie4,5. Mittlerweile hat es eine lange Bearbeitungszeit von 4 bis 6 Wochen und erfordert das Fachwissen erfahrener Techniker5. Die histopathologische Untersuchung (HPE) ist eine wichtige Technik zur Diagnose von GUTB5, obwohl HPE außer dem Vorhandensein säurefester Bakterien (AFB) nicht pathognomonisch ist, da sie nicht zwischen GUTB und anderen granulomatösen Erkrankungen unterscheiden kann6,7. Offensichtlich sind Ultraschall, Computertomographie und intravenöse Urographie die wichtigsten bildgebenden Verfahren für die Diagnose einer GUTB bei Männern und Frauen, während bei der Diagnose einer GUTB bei Frauen hauptsächlich Laparoskopie und Hysterosalpingographie zum Einsatz kommen4,8, jedoch reicht kein bildgebendes Verfahren allein für eine eindeutige Diagnose aus.

Bemerkenswert ist, dass die Entnahme von GUTB-Proben, z. B. Prostata-/Nierenbiopsien und EBs, mühsam ist, da es sich dabei um ein streng invasives Verfahren handelt. Es wäre lohnenswert, leicht zugängliche Proben wie Urin, Plasma/Serum usw. zu untersuchen.4, 6. Der Hauptvorteil des Sammelns von Urin gegenüber anderen Bioflüssigkeiten besteht darin, dass er leicht in großen Mengen verfügbar ist und auf nicht-invasive Weise gewonnen werden kann9. Allerdings schwankt die Konzentration verschiedener Biomarker und biochemischer Bestandteile im Urin sehr stark und ist aufgrund der unterschiedlichen Flüssigkeitsaufnahme, des Zeitpunkts der Probenentnahme, des Alters und des unterschiedlichen Gesundheitszustands der einzelnen Personen sehr dynamisch9.

Extrazelluläre Vesikel (EVs), die membrangebundenen flüssigen Biopsien, kommen in verschiedenen Körperflüssigkeiten vor, darunter Urin, Serum und Pleura-/Aszitesflüssigkeit10,11. Die drei Haupttypen von EVs (Nanostrukturen) sind Mikrovesikel (MVs), Exosomen und apoptotische Körper, die anhand ihrer Biogenese, Größe und Funktion unterschieden werden12. Bemerkenswerterweise entstehen Exosomen (30–150 nm) oder intraluminale Vesikel auf endosomalem Weg, MVs (100 nm–1 µm) werden durch Einklemmen oder direktes Ausknospen der Zellplasmamembran gebildet und apoptotische Körper (50–5000 nm) werden freigesetzt durch absterbende Zellen in den extrazellulären Raum11,12,13. Da reiner Urin eine geringe Konzentration an Mtb-Biomarkern enthält, können aus Urinproben von TB-Patienten isolierte EVs diese Biomarker konzentrieren und die Verunreinigungen entfernen, was zu einer besseren Ausbeute bei der Auswertung mit einer empfindlichen Methode, z. B. Immuno-PCR (I-PCR), führt )14. Wir haben mittels I-PCR einzelnes Lipoarabinomannan (LAM) und CFP-10 (Rv3874) in den Urin-EVs von TB-Patienten nachgewiesen, die eine Überlegenheit gegenüber ELISA14 zeigten; Der LAM-Nachweis mittels I-PCR zeigte eine bessere Empfindlichkeit als der CFP-10-Nachweis, diese Biomarker wurden jedoch bei GUTB-Patienten nicht evaluiert.

Darüber hinaus wurde bei TB-Patienten durch einen nanobasierten I-PCR-Assay ein Cocktail aus Mtb MPT-64 (Rv1980c) und CFP-10-Biomarkern identifiziert, nämlich. Magnetkügelchen-gekoppelte Gold-Nanopartikel-basierte I-PCR (MB-AuNP-I-PCR) mit ermutigenden Ergebnissen15, obwohl exklusive GUTB-Proben nicht mit dieser Methode bewertet wurden. Bemerkenswert ist, dass die Nützlichkeit von MBs (zur Kopplung von Fängerantikörpern) und funktionalisierten AuNPs (konjugiert mit Detektionsantikörpern/Oligonukleotiden) in der MB-AuNP-I-PCR eine homogene Bindung von Antikörpern an die Zielantigene im Flüssigkeitssystem ermöglicht und so eine Verringerung der Hintergrundsignale gewährleistet sowie Beispielmatrixeffekt16,17. Wir haben auch einen Cocktail aus MPT-64 und ESAT-6 (Rv3875) in klinischen Proben (EBs und Urin) von GUTB-Patienten mittels I-PCR mit mäßiger Sensitivität/Spezifität nachgewiesen5. Gleichzeitig gelten LAM und MPT-64 als potenzielle Biomarker zur Diagnose von aktiver Tuberkulose im Urin/Urin-EVs5,14,18. Um die diagnostische Genauigkeit der I-PCR weiter zu verbessern, wollten wir in dieser Studie einen Cocktail aus LAM+MPT-64 in den Urin-EVs von GUTB-Patienten durch MB-AuNP-I-PCR nachweisen und diese Ergebnisse direkt mit I vergleichen -PCR- und Magneto-ELISA-Assays. Darüber hinaus haben wir unsere MB-AuNP-I-PCR-Ergebnisse mit dem quantitativen SYBR Green MB-AuNP-Echtzeit-I-PCR-Assay (MB-AuNP-RT-I-PCR) validiert.

In einer vorläufigen Studie wurde festgestellt, dass unter 10 Urinproben von klinisch vermuteten GUTB-Fällen 6, 5 und 3 Fälle positiv für den LAM+MPT-64-Nachweis durch MB-AuNP-I-PCR, I-PCR und Magneto-ELISA waren. jeweils. Daher wurde versucht, die Empfindlichkeit der MB-AuNP-I-PCR durch den Nachweis von LAM+MPT-64 in Urin-EVs von GUTB-Patienten zu verbessern. Zuvor wurden Urin-EVs durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) charakterisiert.

TEM-Aufnahmen von Urin-EVs von GUTB-Fällen zeigten, dass ihre Größe zwischen 52,6 und 184 nm schwankte, wohingegen die Größe der Urin-EVs gesunder Kontrollpersonen zwischen 79,4 und 137 nm schwankte (Abb. 1a, b). Allerdings lag die mittlere Partikelgröße der Urin-EVs von GUTB-Fällen in dieser Studie mit der NTA-Technik zwischen 203 ± 81,8 und 220,4 ± 84 nm.

TEM-Bilder zeigen (a) die Größe der von GUTB-Patienten isolierten Urin-EVs, (b) die Größe der von gesunden Kontrollpersonen isolierten Urin-EVs und (c) die Größe von ~ 20 nm großen AuNPs.

Ein einzelner Peak bei 524,2 nm wurde für AuNPs durch UV-Vis-Spektroskopie beobachtet (ergänzende Abbildung 1a), während TEM-Bilder zeigten, dass AuNPs kugelförmig mit einer durchschnittlichen Größe von ~ 20 nm waren (Abb. 1c). Darüber hinaus wurde die Anzahl der pro AuNP gebundenen Signal-DNA-Moleküle in den funktionalisierten AuNPs durch Fluoreszenzspektrophotometrie bestimmt. Zunächst wurde eine Standardkurve zwischen der Fluoreszenzintensität und verschiedenen Konzentrationen von Fluoresceinamidit-markierter Signal-DNA (FAM-Signal-DNA) (im Bereich von 0,5 bis 2 fmol/µL) aufgezeichnet (Abb. 2). Die Replikate der „mittleren Fluoreszenzintensitätswerte“ für jeden Bezugspunkt dieser Grafik aus zwei unabhängigen Experimenten sind in der Ergänzungstabelle 1 dargestellt. Die Konzentration der freigesetzten Signal-DNA in den funktionalisierten AuNPs betrug 1,17 fmol/µL, was 0,468 ergab pmol/µL nach Multiplikation mit einem Verdünnungsfaktor von 1:400 und ergab 73,3 Signal-DNA-Moleküle pro AuNP in den funktionalisierten AuNPs.

Eine Standardkurve wurde zwischen der Fluoreszenzintensität und verschiedenen Konzentrationen (von 0,5 bis 2 fmol/µL) der FAM-Signal-DNA aufgezeichnet. Die Regressionsgleichung lautete y = 36,91x+12,75. Die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte wurden aus zwei Replikaten im Diagramm abgeleitet. Jeder Bezugspunkt stellt den Mittelwert zweier unabhängiger Experimente dar, die in Duplikaten durchgeführt wurden.

Funktionalisierte AuNPs gekoppelt mit Detektionsantikörpern und Oligonukleotiden wurden durch UV-Vis-Spektroskopie, ELISA, PCR, TEM, Rasterkraftmikroskopie (AFM) sowie Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) charakterisiert. Bemerkenswerterweise zeigten funktionalisierte AuNPs durch UV-Vis-Spektroskopie eine Verschiebung des Absorptionsmaximums ungebundener AuNPs von 524,2 auf 533,8 nm (ergänzende Abbildung 1b), wodurch die Konjugation von Detektionsantikörpern und Oligonukleotiden an AuNPs validiert wurde. Darüber hinaus wurde die Konjugation von Detektionsantikörpern an AuNPs durch ELISA bestätigt (ergänzende Abbildung 2a), wobei funktionalisierte AuNPs (die Detektionsantikörper enthielten) im Vergleich zu ungebundenen AuNPs eine signifikant höhere mittlere optische Dichte (OD) (p <0, 001) zeigten. Gleichzeitig wurde die Konjugation der Signal-DNA an die funktionalisierten AuNPs durch konventionelle PCR validiert (ergänzende Abbildung 2b), wobei eine spezifische Bande von 76 bp beobachtet wurde.

Durch FTIR-Spektroskopie wurden Veränderungen in typischen Banden von AuNPs nachgewiesen, die mit Detektionsantikörpern und funktionalisierten AuNPs konjugiert waren. FTIR-Spektren vor und nach der Funktionalisierung von AuNPs sind in Abb. 3 dargestellt, wobei eine Bande von 3300–3600 cm−1 aufgrund der O-H/N-H-Streckung in AuNPs, AuNPs+Detektionsantikörpern sowie funktionalisierten AuNPs beobachtet wurde. Allerdings wurde bei funktionalisierten AuNPs (grüne Linie) im Vergleich zu AuNPs (blaue Linie) und AuNPs+Detektionsantikörpern (orange Linie) eine Verbreiterung derselben Bande festgestellt, was auf eine Stabilisierung von AuNPs durch Funktionalisierung durch Abbau von O-H schließen lässt /N-H-Bindungen. Eine weitere charakteristische Bande (entsprechend der CH-Streckung) bei 2911 cm−1 und 2982 cm−1 wurde in AuNPs bzw. AuNPs+Detektionsantikörpern beobachtet, die jedoch in den funktionalisierten AuNPs fehlte, da sie nach der Funktionalisierung mit Detektionsantikörpern deformiert wurde/ Oligonukleotide. Darüber hinaus deuteten die Banden in AuNPs und AuNPs+Detektionsantikörpern bei 1643 cm−1 und 1386 cm−1 auf eine asymmetrische und symmetrische Streckung der C=O-Biegeschwingungen hin, die bei den funktionalisierten AuNPs weniger intensiv war. Die meisten Banden verschwanden bei AuNPs zwischen 1000 und 1500 cm−1 nach der Funktionalisierung. Nach der Funktionalisierung von AuNPs wurde jedoch eine Bandenverschiebung von 1088 auf 1092 cm−1 beobachtet. Die in FTIR-Spektren beobachteten Bandenänderungen bestätigten die stabile Konjugation von AuNPs mit Detektionsantikörpern sowie in funktionalisierten AuNPs.

FTIR-Spektren von: AuNPs (blaue Linie), mit polyklonalen Kaninchen-Anti-LAM+Anti-MPT-64-Antikörpern konjugierten AuNPs (pAbs, Nachweisantikörper) (orange Linie) und funktionalisierten AuNPs (konjugiert mit Nachweisantikörpern und Oligonukleotiden) (grün). Linie).

Die 3D-Topographie von AuNPs, AuNPs + Nachweisantikörpern und funktionalisierten AuNPs ist in Abb. 4a – c (Einschub i) dargestellt. Interessanterweise zeigten AFM-Bilder eine Höhenverteilung zwischen 15 und 35 nm für AuNPs (Abb. 4a, Einschub ii) und eine mittlere Höhe von 40 nm für AuNPs + Nachweisantikörper (Abb. 4b, Einschub ii). Gleichzeitig wurde die mittlere Höhe für funktionalisierte AuNPs auf 70 nm erhöht (Abb. 4c, Einschub ii). Bemerkenswert ist, dass eine Zunahme der Höhe der AuNPs nach der Konjugation mit Detektionsantikörpern und der Funktionalisierung auf die Bildung und Aggregation größerer Partikel hinweist.

AFM-Bilder zeigen (a) AuNPs, wobei der Einschub (i) die 3D-Topographie und der Einschub (ii) die Höhenverteilung darstellt, (b) AuNPs, die mit „Kaninchen-Anti-LAM+Anti-MPT-64“-pAbs konjugiert sind, wobei der Einschub (i) 3D darstellt Topographie und Einschub (ii) stellt die Höhenverteilung dar, während (c) funktionalisierte AuNPs sind, wobei Einschub (i) die 3D-Topographie und Einschub (ii) die Höhenverteilung darstellt.

Die Kopplung von Fängerantikörpern, dh Meerschweinchen-Anti-Mtb-pAbs, mit MBs wurde durch Messung der OD bei 405 nm mit Magneto-ELISA bestätigt, die eine signifikant höhere mittlere OD (p <0, 001) als ungebundene MBs aufwies (ergänzende Abbildung 3a). Darüber hinaus wurde die Konjugation von Fängerantikörpern an MBs durch UV-Vis-Spektroskopie bei 270 nm kreuzvalidiert, was eine signifikant höhere mittlere OD (p <0, 001) im Vergleich zu ungebundenen MBs zeigte (ergänzende Abbildung 3b).

Die schematischen Darstellungen für MB-AuNP-I-PCR/MB-AuNP-RT-I-PCR und I-PCR/Magneto-ELISA sind in der ergänzenden Abbildung 4a bzw. b dargestellt. Wir haben durch MB-AuNP-I-PCR und I-PCR eine LOD von 1 fg/ml für gereinigtes Mtb LAM+MPT-64 (in Puffer) erhalten (Abb. 5a,b). Interessanterweise wurde bei Urin-EVs gesunder Personen (n = 5), die mit gereinigtem LAM+MPT-64 versetzt wurden, ein ähnlicher LOD von 1 fg/ml durch MB-AuNP-I-PCR erhalten, was auf keinen Probenmatrixeffekt schließen lässt I-PCR zeigte einen höheren LOD von 10 fg/ml (Daten nicht gezeigt), was auf das Vorhandensein eines Probenmatrixeffekts schließen lässt. Die Werte des Schwellenwertzyklus (Ct) wurden durch Einstellen der Fluoreszenz in der exponentiellen Phase der Amplifikationskurven für SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR bestimmt. Die Standardkurve wurde zwischen den Ct-Werten und den logarithmisch gereinigten LAM+MPT-64-Konzentrationen aufgetragen (Abb. 6a), wobei der endgültige Nachweisbereich von LAM+MPT-64 bei 100 fg/ml–10 ng/ml lag MB-AuNP-RT-I-PCR mit einem LOD von 45 fg/ml. Im Gegensatz dazu zeigte Magneto-ELISA einen endgültigen Nachweisbereich zwischen 100 pg/ml und 1 µg/ml mit einer LOD von 100 pg/ml (Abb. 6a). Die Wiederholungen der mittleren Ct- und OD-Werte für jeden Bezugspunkt dieser Grafik aus zwei unabhängigen Experimenten sind in der Ergänzungstabelle 2 dargestellt. Darüber hinaus wurden mit MB-AuNP-RT-I-LODs von 60 fg/ml und 400 pg/ml erreicht. PCR bzw. Magneto-ELISA in Urin-EVs (einer gesunden Person), die mit gereinigtem LAM+MPT-64 versetzt waren (ergänzende Abbildung 5), was einen geringfügigen Probenmatrixeffekt mit MB-AuNP-RT-I-PCR impliziert. im Vergleich zum Magneto-ELISA.

(a) LOD-Bestimmung für das gereinigte Mtb LAM+MPT-64 durch MB-AuNP-I-PCR-Assay, wobei ein 76-bp-Amplikon einen positiven Test auf 4 % Agarosegel anzeigte: Spur M, 20-bp-Leiter; Spuren 1–12, serielle zehnfache Verdünnungen des gereinigten LAM+MPT-64 (von 1 µg/ml bis 10 Ag/ml); Spur 13, I-PCR-Negativkontrolle (kein Antigen beschichtet, restliche hinzugefügte Reagenzien); Spur 14, PCR-negative Kontrolle (keine Template-DNA); Spur 15, PCR-positive Kontrolle (Signal-DNA, 1 ng/ml). Die Experimente wurden dreimal durchgeführt und eine der repräsentativen Figuren wurde gezeigt. (b) LOD-Bestimmung für das gereinigte Mtb-LAM+MPT-64 durch I-PCR-Assay, wobei ein 470-bp-Amplikon einen positiven Test auf 2 % Agarosegel anzeigte: Spur M, 100-bp-Leiter; Spuren 1–12, serielle zehnfache Verdünnungen des gereinigten LAM+MPT-64 (von 1 µg/ml bis 10 Ag/ml); Spur 13, I-PCR-Negativkontrolle (kein Antigen beschichtet, restliche hinzugefügte Reagenzien); Spur 14, PCR-negative Kontrolle (keine Template-DNA); und Spur 15, PCR-positive Kontrolle (reporterbiotinylierte DNA, 1 ng/ml). Die Experimente wurden dreimal durchgeführt und eine der repräsentativen Figuren wurde gezeigt.

(a) Die Standardkurve(n) für das gereinigte LAM+MPT-64 durch MB-AuNP-RT-I-PCR (von 100 fg/ml bis 10 ng/ml) und Magneto-ELISA (von 100 pg/ml bis). 1 µg/ml): Für MB-AuNP-RT-I-PCR wurde ein Korrelationskoeffizient von 0,928 ermittelt und die entsprechende Regressionsgleichung lautete Ct = − 1,11 × ln (konz.)+28,84. Die mittleren Ct- (für MB-AuNP-RT-I-PCR) und OD-Werte (für Magneto-ELISA) wurden aus zwei Replikaten abgeleitet. Jeder Bezugspunkt stellt den Mittelwert zweier unabhängiger Experimente dar, die in Duplikaten durchgeführt wurden. (B). Streudiagramm für MB-AuNP-RT-I-PCR und Magneto-ELISA, in dem für MB-AuNP-RT eine größere Variabilität [Variationskoeffizient (CV) von 80,6 vs. 50,9 %] in der LAM+MPT-64-Konzentration beobachtet wurde -I-PCR, verglichen mit Magneto-ELISA. Schwarze horizontale Linien zeigen den Medianwert sowohl für MB-AuNP-RT-I-PCR als auch für Magneto-ELISA an.

Wir erreichten Sensitivitäten von 100 % [95 %-Konfidenzintervall (KI) 59–100 %] und 85 % (95 %-KI 70,2–94,3 %) durch MB-AuNP-I-PCR in Urin-EVs von sieben bestätigten und 40 klinisch vermuteten GUTB Patienten (Tabelle 1) gegen den zusammengesetzten Referenzstandard (CRS) [eine Kombination aus klinischen Merkmalen, Bildgebung, Abstrich/Kultur, GeneXpert, IS6110-PCR und Reaktion auf die Anti-Tuberkulose-Therapie (ATT)]. Bemerkenswerterweise zeigte die MB-AuNP-I-PCR sowohl bei klinisch vermuteten als auch bei allen GUTB-Fällen signifikant höhere (p < 0,05–0,01) Empfindlichkeiten als I-PCR/Magneto-ELISA. Unter den 35 Nicht-TB-Kontrollen zeigten nur ein bzw. drei Fälle falsch positive Ergebnisse, was eine Spezifität von 97,1 % (95 %-KI 85,1–99,9 %) und 91,4 % (95 %-KI 76,9–98,2 %) durch MB-AuNP-I zeigte -PCR bzw. I-PCR/Magneto-ELISA (Tabelle 1). Repräsentative Beispiele für GUTB-Fälle und Nicht-TB-Kontrollen, die durch MB-AuNP-I-PCR auf der Grundlage des LAM+MPT-64-Nachweises in Urin-EVs bewertet wurden, sind in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt.

Bemerkenswert ist, dass durch MB-AuNP-RT-I-PCR ein breiter Bereich von 400 fg/ml–11 ng/ml der LAM+MPT-64-Konzentration in den Urin-EVs von GUTB-Fällen nachgewiesen wurde, während ein schmaler Bereich (2–11 ng /ml) desselben wurde durch Magneto-ELISA nachgewiesen. Um die Variabilität der Beobachtungen zu bestimmen, wurden Streudiagramme von MB-AuNP-RT-I-PCR und Magneto-ELISA erstellt (Abb. 6b), wobei für MB-AuNP-RT-I-PCR ein höherer Variationskoeffizient (CV) erreicht wurde. I-PCR im Vergleich zu Magneto-ELISA (80,6 vs. 50,9 %), was den Nachweis eines größeren Bereichs von LAM+MPT-64-Konzentrationen in Urin-EVs von GUTB-Patienten durch MB-AuNP-RT-I-PCR als durch Magneto-ELISA zeigt. ELISA. Anschließend sind die mittleren Ct- und OD-Werte (von zwei Replikaten), die für jeden Patienten durch die quantitative MB-AuNP-RT-I-PCR und den Magneto-ELISA ermittelt wurden, in Tabelle 2 aufgeführt. Für MB-AuNP-RT-I-PCR gilt: Die mittleren Ct-Werte unter NC+3SD (26,20) wurden als positiv für GUTB-Fälle angesehen, während Werte über 26,20 als Nicht-TB-Patienten galten. Gleichzeitig wurden die mittleren OD-Werte, die größer als „mittlere OD der Nicht-TB-Kontrollgruppe + 2SD“ (0,189) waren, durch Magneto-ELISA als positiv für GUTB-Fälle angesehen, während Werte unter 0,189 als Nicht-TB-Patienten betrachtet wurden. Dies zeigte eine Sensitivität von 85,7 % (95 %-KI 63,7–96,9 %) und eine Spezifität von 95 % (95 %-KI 75,1–99,9 %) durch MB-AuNP-RT-I-PCR in 21 klinisch vermuteten GUTB-Fällen und 20 nicht -TB-Kontrollen (Tabelle 3), die mit den MB-AuNP-I-PCR-Ergebnissen vergleichbar waren.

Die Diagnose von GUTB ist eine abschreckende Herausforderung. In dieser Studie haben wir mittels MB-AuNP-I-PCR-Assay einen Cocktail aus Mtb-LAM- und MPT-64-Biomarkern in Urin-EVs von GUTB-Patienten nachgewiesen. Wir verwendeten das „Total-Exosome-Isolierungsreagenz“, um Urin-EVs aus GUTB-Fällen zu isolieren, wie in einer früheren Studie14. Urin-EVs werden normalerweise durch Ultrazentrifugation und Saccharose-Gradientenzentrifugation isoliert19,20, doch diese Methoden haben eine längere Durchlaufzeit und liefern eine geringe Ausbeute an EVs. TEM-Aufnahmen von Urin-EVs von GUTB-Patienten und gesunden Kontrollpersonen zeigten eine Größe zwischen 52,6 und 184 nm (Abb. 1a, b). Dieser Befund stimmt gut mit einem früheren Bericht überein21, in dem die Größe der Urin-EVs von Prostatakrebspatienten und gesunden Kontrollpersonen (isoliert durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation) laut TEM zwischen 20 und 230 nm lag. Gleichzeitig lag die mittlere Partikelgröße der Urin-EVs von GUTB-Patienten, die mit der NTA-Technik beurteilt wurden, in dieser Studie zwischen 203 ± 81,8 und 220,4 ± 84 nm. NTA weist jedoch mehrere Einschränkungen auf, da eine vibrationsfreie Umgebung und die Analyse weniger viskoser Proben erforderlich sind22, obwohl wir die Größe der Urin-EVs sowohl durch NTA- als auch durch TEM-Analyse bewertet haben.

Darüber hinaus wurden durch TEM leicht polydisperse und kugelförmige ~ 20 nm große AuNPs beobachtet (Abb. 1c), die anschließend mit „Kaninchen-Anti-LAM+MPT-64“-pAbs (Nachweisantikörpern) und Oligonukleotiden funktionalisiert wurden. Dies führte zu einer Rotverschiebung von 524,2 nm (entsprach einer charakteristischen Oberflächenplasmonresonanzbande von AuNPs) auf 533,8 nm im UV-Vis-Spektrum, was die Konjugation von Detektionsantikörpern/Oligonukleotiden an AuNPs bestätigte (ergänzende Abbildung 1b). Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Berichten über die UV-Vis-spektroskopische Charakterisierung funktionalisierter AuNPs zum Nachweis gereinigter Mtb-ESAT-6- und CFP-10-Proteine ​​durch AuNP-RT-I-PCR/MB-AuNP-I-PCR-Assays17,23. 24. Beim Nachweis von Interleukin-3 und Stammzellfaktor mittels AuNP-RT-I-PCR dokumentierten Potuckova et al.25 eine Verschiebung der Wellenlänge um 5–10 nm, wenn AuNPs mit Nachweisantikörpern/Oligonukleotiden konjugiert wurden. Bemerkenswert ist, dass die Anzahl der pro 20 nm AuNP gebundenen Signal-DNA-Moleküle in den funktionalisierten AuNPs mit ~ 73 Molekülen/AuNP ermittelt wurde (Abb. 2), was mit den vorherigen Berichten übereinstimmt26, 27, in denen 75–100 Signalmoleküle vorhanden waren DNA wurde pro AuNP mit einer Größe von 30 nm angebracht.

Die Konjugation von „Anti-LAM+MPT-64“-Antikörpern an die funktionalisierten AuNPs wurde auch durch ELISA bestätigt (ergänzende Abbildung 2a), wobei für funktionalisierte AuNPs im Vergleich zu ungebundenen AuNPs eine signifikant höhere OD (p <0,001) beobachtet wurde . In der Zwischenzeit zeigten die funktionalisierten AuNPs durch PCR ein 76-bp-Amplikon (ergänzende Abbildung 2b), was die Konjugation von Signal-DNA an die funktionalisierten AuNPs bestätigte. Ebenso wurde beim Nachweis von gereinigtem Mtb CFP-10 und CFP-10+MPT-64 durch AuNP-RT-I-PCR/MB-AuNP-I-PCR die Anlagerung von Nachweisantikörpern und Oligonukleotiden an die funktionalisierten AuNPs durch ELISA und PCR bestätigt bzw.15,23.

Zur Charakterisierung der funktionalisierten AuNPs in der vorliegenden Studie wurde FTIR-Spektroskopie eingesetzt (Abb. 3), wobei eine Bande zwischen 3300 und 3600 cm-1 aufgrund der O-H/N-H-Streckung in AuNPs, AuNPs+Detektionsantikörpern und funktionalisierten AuNPs beobachtet wurde AuNPs. Bei den funktionalisierten AuNPs wurde jedoch eine Verbreiterung derselben Bande festgestellt (Abb. 3), was auf eine Stabilisierung der AuNPs durch Funktionalisierung durch Aufbrechen der O-H/N-H-Bindungen schließen lässt. In ähnlicher Weise zeigten FTIR-Spektren von AuNPs zwei Hauptpeaks für die OH- und C=O-Streckschwingung bei 3307 bzw. 1635 cm−1, wohingegen ein mittlerer Peak bei 1365 cm−1 beobachtet wurde (entsprechend der CO-Streckschwingung)28. Das gleiche Phänomen wurde auch in FTIR-Spektren von AuNPs dokumentiert, die mit „Maus-Anti-HBsAg (Hepatitis-B-Oberflächenantigen)“ mAbs gekoppelt waren29, wobei der charakteristische Peak, der bei ungebundenen AuNPs bei 3435 cm−1 beobachtet wurde (aufgrund von OH-Streckschwingungen), bei AuNPs verschwand wurden mit Detektionsantikörpern gekoppelt. Zusätzlich wurden drei Peaks bei 1650 cm−1/616 cm−1 und 3335 cm−1 aufgrund der N-H-Deformation bzw. der N-H-Streckschwingungen beobachtet, was die Kopplung des Anti-HBsAg kreuzbestätigt ' mAbs mit AuNPs29.

Gleichzeitig wurde AFM verwendet, um die Oberflächentopographie und Höhenverteilung von AuNPs, AuNPs+Detektionsantikörpern und funktionalisierten AuNPs zu bewerten (Abb. 4), wobei eine Zunahme der Höhe die Konjugation von Detektionsantikörpern/Oligonukleotiden an funktionalisierte AuNPs anzeigte. Im Gegensatz zu ungebundenen AuNPs wurde durch AFM ein ähnlicher Anstieg der Höhe beobachtet, wenn AuNPs mit Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert wurden30,31. In ähnlicher Weise zeigten UV-Vis-Spektren von Phenylalanin-Kohlenstoff-Quantenpunkten (Phe-CQDs), den biokompatiblen, ungiftigen Nanomaterialien, zwei Absorptionspeaks bei 250 und 340 nm, was auf die charakteristische Absorption des aromatischen π-Systems schließen lässt32. Darüber hinaus zeigte AFM der Phe-CQDs eine 3D-Topographie mit einer mittleren Höhe von 5 nm, während FTIR breite Absorptionsbanden zwischen 3100 und 3500 cm-1 aufgrund von O-H- und N-H-Schwingungen zeigte32.

Die Konjugation von Fängerantikörpern an MBs wurde durch Magneto-ELISA sowie UV-Vis-Spektroskopie bestätigt (ergänzende Abbildung 3a, b). Dieselben Techniken wurden verwendet, um die Kopplung von Fängerantikörpern mit MBs in früheren Arbeiten zu bestätigen 15, 17, 24 . Anschließend bestimmten wir einen LOD von 1 fg/ml für das gereinigte Mtb LAM+MPT-64 durch MB-AuNP-I-PCR in Puffer (Abb. 5a) sowie für Urin-EVs (von gesunden Personen), die mit dem gereinigten Antigen versetzt waren und zeigte keinen Probenmatrixeffekt. In ähnlicher Weise wurden durch MB-AuNP-I-PCR sowohl in Puffer- als auch in Speichelproben LODs von 1 fg/ml und 10 fg/ml ohne Probenmatrixeffekt für gereinigtes Mtb CFP-10+MPT-64 bzw. ESAT-6 erhalten versetzt mit gereinigtem Antigen15,17. Allerdings zeigten beide I-PCR/Magneto-ELISA in der vorliegenden Studie einen Probenmatrixeffekt, der sich in höheren LODs zeigte, die in Urin-EVs (gesunder Personen) erhalten wurden, die mit gereinigtem LAM+MPT-64 versetzt waren, als in Puffer. Gleichzeitig wurde HIV-1-p24-Gag-Protein durch MB-AuNP-RT-I-PCR mit < 200 CD4+T-Zellen/μl im Plasma von HIV-1-infizierten Männern nachgewiesen33. Staphylokokken-Enterotoxin B wurde auch durch magnetische Mikropartikel-AuNP-RT-I-PCR16 in verschiedenen Lebensmittelproben in Konzentrationen von bis zu 269 fg/ml nachgewiesen.

Bemerkenswert ist, dass in Blutproben von AIDS-Patienten mittels Magneto-ELISA34 CD4+-Zellen in einer Konzentration von bis zu 50 Zellen/µL nachgewiesen wurden. Im Gegensatz zu synthetischen MBs, die in der vorliegenden Studie für Magneto-ELISA und MB-AuNP-I-PCR verwendet wurden, verwendeten Oh et al.35 mit Silica beschichtete Fe3O4-Nanocluster („magnetische Nanokügelchen“), um einen magnetischen Nanozym-gebundenen Immunosorbens-Assay zu entwickeln erreichte einen LOD von 100 pg/ml zum Nachweis des Influenza-A-Virus. Umgekehrt wurden biogene Magnetosomen von Magnetospirillum gryphiswaldense in der Magneto-I-PCR verwendet, um das gereinigte HBsAg in menschlichen Seren mit einem LOD von 320 pg/ml36 nachzuweisen. Allerdings weisen biogene Magnetosomen aufgrund der begrenzten Toleranz gegenüber Detergenzien und der geringeren Stabilität ihrer biologischen Membranen einige Einschränkungen auf15,17.

Wir erzielten eine hohe Sensitivität (87,2 %) und Spezifität (97,1 %) durch MB-AuNP-I-PCR basierend auf dem LAM+MPT-64-Nachweis in Urin-EVs von insgesamt 47 GUTB-Patienten bzw. 35 Nicht-TB-Kontrollen in Bezug auf CRS (Tabelle 1). Darüber hinaus war die mit MB-AuNP-I-PCR erreichte Sensitivität signifikant höher (p < 0,05–0,01) als mit I-PCR (68,1 %) und Magneto-ELISA (61,7 %). Wir haben unsere MB-AuNP-I-PCR-Ergebnisse auch mit der quantitativen SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR bestätigt, die nahezu gleichwertige Ergebnisse (85,7 % Sensitivität und 95 % Spezifität) zur Diagnose klinisch vermuteter GUTB-Patienten in Urin-EVs zeigte ( Tisch 3). Beim Vergleich des LAM+MPT-64-Nachweises in Urin-EVs von GUTB-Fällen durch MB-AuNP-I-PCR in dieser Studie mit dem Nachweis von CFP-10+MPT-64 durch MB-AuNP-I-PCR in EPTB-Proben (Pleural-/ Aszitesflüssigkeit, Eiter usw.)15, der LAM+MPT-64-Nachweis ergab eine höhere Empfindlichkeit (87,2 vs. 78,1 %) als letzterer. Dies könnte auf den Nachweis eines Cocktails aus LAM+MPT-64 zurückzuführen sein, wobei LAM (anstelle von CFP-10) als günstigerer Biomarker für den TB-Nachweis in Urin/Urin-EVs gilt14,37. Darüber hinaus war die LAM+MPT-64-Konzentration wahrscheinlich in den Urin-EVs von GUTB-Fällen erhöht, verglichen mit reinen EPTB-Proben, die in einer früheren Studie verwendet wurden15. In ähnlicher Weise zeigte sich beim Vergleich des LAM+MPT-64-Nachweises in Urin-EVs von GUTB-Fällen durch MB-AuNP-I-PCR mit dem LAM-Nachweis in Urin-EVs von EPTB-Fällen insgesamt durch konventionelle I-PCR der Nachweis von LAM+MPT-64 bessere Sensitivität (87,2 vs. 67,9 %) und Spezifität (97,1 vs. 92,7 %) als letztere14. Dies war höchstwahrscheinlich auf den Nachweis von LAM+MPT-64 (anstelle von LAM allein) in Urin-EVs, auf die unterschiedliche Beschaffenheit der Proben (GUTB vs. Gesamt-EPTB) in den beiden Studien und, was noch wichtiger ist, auf die Verwendung von MB-AuNP-I zurückzuführen. PCR ist eine relativ präzisere Methode als die I-PCR zum Nachweis von Biomarkern in klinischen Proben15.

Bemerkenswert ist, dass es zwei unterschiedliche Populationen von EVs gibt, die von Mtb-infizierten Makrophagen freigesetzt werden, z. B. diejenigen, die die Zellmarker der EVs des Wirts (CD63/CD9) und die Mtb-Marker wie Lipoglycane (LAM) und Lipoproteine ​​(LpqH) einschließen, die beide angeborenen regulieren und erworbene Immunantworten38,39. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass Mycobacterium bovis BCG-infizierte menschliche THP-1- und Maus-J774-Makrophagen Exosomen freisetzen, die LAM, LpqH und Ag85-Komplex enthalten40. Darüber hinaus hängt die Freisetzung von mykobakteriellen EVs (MEVs), die LAM/LpqH enthalten, von der Lebensfähigkeit von Mtb ab, was bedeutet, dass eine aktive Mtb-Replikation für die MEV-Erzeugung unerlässlich ist38,39, was darauf hindeutet, dass der Nachweis von LAM/LpqH in MEVs auf eine aktive TB-Erkrankung hinweisen könnte. Humorale Reaktionen auf MEVs (die LAM enthalten) mit Seren von HIV-negativen Lungen-TB-Patienten wurden auch durch ELISA- und Immunoblot-Techniken dokumentiert41. Vergleichbar mit dem LAM+MPT-64-Nachweis in Urin-EVs wurden die Peptide Mtb CFP-2 (Rv2376c), MPT-32 (Rv1860), MPT-64 und BfrB (Rv3841) in Serum-Exosomen von TB-Patienten durch erweiterte Mehrfachreaktionsüberwachung nachgewiesen -Massenspektrometrie (MRM-MS)42, obwohl diese Methode nicht für die Diagnose von Tuberkulose im Feld geeignet ist. Zusätzlich wurden durch MRM-MS43 die Peptide Mtb GlnA1 (Rv2220), GarA (Rv1827), GroES (Rv3418c) und DnaK (Rv0350) in Serum-Exosomen latenter TB-Individuen nachgewiesen. Die Identifizierung zirkulierender, aus Blutplättchen stammender EVs mittels Durchflusszytometrie wurde auch bei COVID-19-Patienten dokumentiert44.

Bemerkenswerterweise könnte die erhöhte Empfindlichkeit (87,2 %), die MB-AuNP-I-PCR in dieser Studie zugeschrieben wird, auch auf die doppelte Amplifikation zurückzuführen sein, d Verstärkung15. Darüber hinaus war die durch MB-AuNP-I-PCR erreichte hohe Spezifität (97,1 %) wahrscheinlich auf kräftiges Waschen und die Eliminierung ungebundener Antigene/Antikörper im Flüssigkeitssystem zurückzuführen, indem ein externes Magnetfeld zur Unterdrückung von Hintergrundrauschen und Probenmatrixeffekten verwendet wurde15,33 . Ebenso zeigten Kim et al.33 eine hohe Sensitivität (99 %) und Spezifität (100 %) durch MB-AuNP-RT-I-PCR basierend auf dem Nachweis des p24-Gag-Proteins in Plasmaproben von HIV-1-infizierten Personen.

Unsere quantitative SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR kann auch die Krankheitsdynamik überwachen, da in den Urin-EVs von GUTB-Patienten ein dynamischer Bereich von LAM+MPT-64 (400 fg/ml bis 11 ng/ml) nachgewiesen wurde ( Abb. 6b). Sowohl LAM als auch MPT-64 stellen Biomarker für die aktive Mtb-Replikation dar. Ihre erhöhten Werte im Urin/Urin-EVs könnten das Fortschreiten der aktiven GUTB-Erkrankung widerspiegeln5,14,39. Wir haben zuvor durch RT-I-PCR verringerte MPT-64+PstS1 (Rv0934)-Konzentrationen in klinischen Proben von Lungen-TB-Patienten unter Therapie und wahrscheinlich die verringerte Bakterienlast nachgewiesen45. In ähnlicher Weise kann diese Arbeit weiter ausgeweitet werden, um den Krankheitsrückgang durch MB-AuNP-RT-I-PCR in Urin-EVs von GUTB-Patienten unter ATT zu bewerten. Allerdings erfordert MB-AuNP-RT-I-PCR teure Echtzeit-PCR-Geräte und qualifizierte Techniker, während MB-AuNP-I-PCR eine vergleichsweise kostengünstigere Methode ist, die zur routinemäßigen Diagnose von GUTB-Fällen eingesetzt werden kann.

Abschließend haben wir einen MB-AuNP-I-PCR-Assay (Flüssigformat) zum Nachweis eines Cocktails aus Mtb LAM+MPT-64 in Urin-EVs von GUTB-Patienten entwickelt, der eine hohe Sensitivität (~ 87 %) und Spezifität (~ 97) zeigte %), im Vergleich zu I-PCR und Magneto-ELISA. Tatsächlich übertraf die durch MB-AuNP-I-PCR erzielte hohe diagnostische Genauigkeit die Sensitivität der WHO-Richtlinien46 für Zielproduktprofile mit hoher Priorität (≥ 80 % Sensitivität und ≥ 98 % Spezifität für die EPTB-Diagnose einschließlich GUTB) und entsprach nahezu der Spezifität einen neuen diagnostischen Test zu planen. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht zum Nachweis von LAM+MPT-64 in Urin-EVs von GUTB-Fällen mittels MB-AuNP-I-PCR mit vielversprechenden Ergebnissen. Nach der Validierung der MB-AuNP-I-PCR-Daten mit einer größeren Probengröße aus verschiedenen epidemiologischen Umgebungen und der Reduzierung der Kosten kann dieser Test in ein attraktives Diagnosekit umgewandelt werden.

Gereinigtes LAM (NR-14848), MPT-64 (NR-44102), Kaninchen-Anti-LAM-pAbs (NR-13821) und Meerschweinchen-Anti-Mtb-CDC1551-pAbs (NR-13818) wurden als großzügige Geschenke von BEI Resources, ATCC, erhalten , Manassas, VA, USA, während Kaninchen-Anti-MPT-64-pAbs von Abcam (Cambridge, UK) gekauft wurden. „Total Exosome Isolation Reagent“ aus Urin (Katalognr. 4484452) wurde von Thermo Fisher Scientific gekauft, während RoboStrips von AJ Roboscreen, Leipzig, Deutschland, gekauft wurden. BSA, Sulfo-SMCC [Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat)] und 1,4-Dithiothreitol (DTT) wurden von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) bezogen.

Am frühen Morgen wurden Mittelstrahlurinproben (ca. 5 ml) von stark suggestiven männlichen/weiblichen GUTB-Patienten und Nicht-TB-Kontrollpersonen (mit deren schriftlicher Einverständniserklärung) im Krankenhaus der Abteilung für Urologie/Geburtshilfe und Gynäkologie der UHS entnommen , Rohtak. Dieser Vorschlag wurde von den Institutional Human Ethics Committees (IHECs) der Maharshi Dayanand University, Rohtak (IHEC/19/02 und IHEC/2021/306) genehmigt und unsere Forschung wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki für menschliche Teilnehmer durchgeführt . Urinproben wurden 30 Minuten lang bei 4 °C und 2000 × g zentrifugiert, um die Zellen/Trümmer zu entfernen, und die Überstände wurden bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert.

Urinproben von GUTB-Patienten (n = 47) wurden grob kategorisiert als: (i) Bestätigte GUTB-Fälle (n = 7), die durch Abstrichmikroskopie mittels Ziehl-Neelsen-Färbung, Kulturidentifizierung für Mtb auf LJ-Medium positiv für AFB waren oder positiv waren GeneXpert5, (ii) Klinisch vermutete GUTB-Fälle (n = 40), die alle abstrichnegativ/kulturnegativ waren, aber auf der Grundlage klinischer Merkmale, Bildgebung, IS6110-PCR und Reaktion auf ATT ausgewählt wurden. Darüber hinaus (iii) Nicht-TB-Kontrollen (n = 35), die Patienten mit Harnwegsinfektionen nicht-TB-Ursprungs (n = 11) und Menstruationsunregelmäßigkeiten (n = 24) umfassten. Allerdings wurden Patienten, die bereits ATT erhielten, und Personen mit nachgewiesenen multiresistenten/extensiv resistenten TB-Fällen zum Zeitpunkt der Probenentnahme ausgeschlossen5. Darüber hinaus wurden Personen mit Symptomen, die auf Lungentuberkulose und andere EPTB-Typen, jedoch nicht auf GUTB, hindeuten, HIV-koinfizierte Personen, Diabetiker/Krebspatienten und Personen, die nach achtwöchiger Therapie nicht auf ATT ansprachen, ausgeschlossen. Das Flussdiagramm der in verschiedene Gruppen unterteilten Studienteilnehmer zur Bewertung der Urin-EVs von GUTB-Fällen und Nicht-TB-Kontrollen für den LAM+MPT-64-Nachweis mittels MB-AuNP-I-PCR/I-PCR und Magneto-ELISA ist in Abb. dargestellt . 7a.

(a) Flussdiagramm zur Gruppierung der Studienteilnehmer (GUTB-Patienten/Nicht-TB-Kontrollen), die auf LAM+MPT-64-Nachweis mittels MB-AuNP-I-PCR/I-PCR und Magneto-ELISA untersucht wurden. (b) Flussdiagramm zur Gruppierung der Studienteilnehmer (GUTB-Patienten/Nicht-TB-Kontrollen), die mittels SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR und Magneto-ELISA auf LAM+MPT-64-Nachweis untersucht wurden.

Darüber hinaus wurden 41 Patienten nach dem Zufallsprinzip ausgewählt (21 klinisch vermutete GUTB-Fälle und 20 Nicht-TB-Kontrollen) und ihre Urin-EVs wurden auf LAM+MPT-64-Nachweis mithilfe einer quantitativen SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR und Magneto-PCR analysiert. ELISA (Abb. 7b).

Urinüberstände von GUTB-Fällen/Nicht-TB-Kontrollen wurden aus dem Kühlschrank entnommen und auf Raumtemperatur gebracht. Gleiche Volumina an Urinüberständen und „Gesamt-Exosomen-Isolierungsreagenz“ wurden gemischt, bis die Lösung homogen wurde14. Die Reaktionsmischungen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1 Stunde lang bei 10.000 × g und 4 °C zentrifugiert. In Pellets vorhandene EVs wurden in 50 μl sterilem PBS resuspendiert.

Der Proteingehalt von Elektrofahrzeugen wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm mit dem Nanodrop TM 2000-Spektrophotometer bestimmt. Die Partikelgröße/Anzahl von Urin-EVs wurde mit Nanosight NS300 NTA (Malvern Panalytical Application Lab, Neu-Delhi) bestimmt. Die Größe und Form von Urin-EVs wurden auch mit Talos F200X TEM (Thermo Fischer; Sophisticated Analytical Instrumentation Facility, All India Institute of Medical Sciences, Neu-Delhi) analysiert, wobei 2 μl frisch zubereiteter EVs auf ein mit Kohlenstoff beschichtetes Gitter und Luft getropft wurden getrocknet. Diese Gitter wurden mit 2 % Phosphorwolframsäurelösung angefärbt und anschließend vor der Bildgebung getrocknet.

Biotinylierte Reporter-DNA wurde durch PCR-Amplifikation des bla-Gens der pUC19-Plasmid-DNA unter Verwendung des 5'-Biotin-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3'-Vorwärtsprimers und des 5'-CCTTCCTGTTTTTGCTCAC-3'-Rückwärtsprimers hergestellt und das amplifizierte Produkt wurde mit einem Gelextraktionskit5 gereinigt und gelagert bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C aufbewahren.

Ein Cocktail aus LAM+MPT-64 wurde durch I-PCR nachgewiesen, wie von Kamra et al.5 beschrieben, mit geringfügigen Modifikationen. RoboStrip-Wells wurden mit 50 μl optimal verdünnter Urin-EVs (mit 200 μg/ml Protein) im Beschichtungspuffer (0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6) beschichtet, was 8,4 × 1011–11,5 × 1011 Partikel/ml mit a ergab mittlere Partikelgröße ± SD von 203 ± 81,8 bis 220,4 ± 84 nm. Um den LOD des gereinigten LAM+MPT-64 zu bestimmen, wurden zehnfache Reihenverdünnungen [von 1 μg/ml bis 10 Attogramm (ag)/ml] im Beschichtungspuffer hergestellt und 50 μl verschiedener Verdünnungsmittel auf RoboStrip-Vertiefungen aufgetragen. Alle Urin-EVs von GUTB-Fällen/Nicht-TB-Kontrollpersonen wurden dreifach analysiert, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen. RoboStrips wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert und anschließend mit PBS, das 0,05 % Tween-20 (PBST, Waschpuffer) enthielt, 1 Minute lang bei Raumtemperatur unter orbitalem Schütteln (400–500 U/min) gewaschen. Als nächstes wurden die RoboStrip-Wells mit einem Blockierungspuffer (3 % BSA in PBST) bei 37 °C für 2 Stunden blockiert, gefolgt von Waschen und Zugabe von 50 µL Kaninchen-Anti-LAM (1:500) + Anti-MPT-64 ( 1:1000)' pAbs. Die übrigen Schritte waren dieselben wie in einem früheren Artikel5 beschrieben.

AuNPs (~ 20 nm) wurden durch chemische Reduktion synthetisiert15. Um die Herstellung von AuNPs zu validieren, wurde die kolloidale Lösung mit UV-Vis-Spektroskopie (UV-1800) zwischen 400 und 700 nm gescannt und die OD aufgezeichnet. Die Größe und Form der AuNPs wurden mit einem 200-kV-TEM analysiert, während die Partikelanzahl in den AuNPs mit der NTA-Technik bestimmt wurde. Für die TEM-Analyse wurden Proben vorbereitet, indem einige Tropfen AuNPs auf das Gitter gegeben und anschließend vor der Bildgebung getrocknet wurden.

Kurz gesagt, Disulfidbindungen einer 1 nM Lösung von 100 μl thiolierter DNA (5′-[C6Thiol] TTTTTTTTTTTTTTTGCTTGTCTCGTAAGTTGAGATTTCGCTATGCACGGTCCTT-3′) wurden unter Verwendung der Zentrifugalfilter gemäß den Anweisungen des Herstellers17 aktiviert, entsalzt und gereinigt und bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert .

Kurz gesagt, 500 μl AuNPs (4 × 109 Partikel/ml) wurden mit 500 μl „Kaninchen-Anti-LAM (1:500)+Anti-MPT-64 (1:1000)“ pAbs (1:1, v/ v) und 45 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Tanzschüttler inkubiert15. Dazu wurden 100 μl aktivierte Fänger-DNA zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 10 % Tween-20, 2 M NaCl (in PBS) sowie 10 % BSA hinzugefügt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überschuss an Fänger-DNA wurde durch 15-minütige Kaltzentrifugation bei 12.000 U/min entfernt und die Partikel wurden in 500 μl PBS resuspendiert. Als nächstes wurden 5 pM Signal-DNA (5′-CTGCGACGATCTACCATCGACGTACCAGGTCGGTTGAAGGACCGTGCATAGCGAAATCTCAACTTACGAGACAAGC-3′) zum Rückstand gegeben, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei 37 °C zur Hybridisierung, während die übrigen Schritte mit denen in einem früheren Artikel identisch waren15. Funktionalisierte AuNPs wurden in PBS resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert17. Die Partikelanzahl in den funktionalisierten AuNPs betrug laut NTA 2 × 109 Partikel/ml.

Um die Anzahl der pro AuNP gebundenen Signal-DNA-Moleküle zu bestimmen, wurden funktionalisierte AuNPs unter Verwendung von FAM-Signal-DNA-Molekülen26 hergestellt, und die restlichen Schritte waren identisch für die Herstellung funktionalisierter AuNPs unter Verwendung von unmarkierter Signal-DNA15. Die nicht hybridisierten FAM-Signal-DNA-Moleküle wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 12.000 U/min entfernt, wohingegen die mit funktionalisierten AuNPs verbundenen FAM-Signal-DNA-Moleküle durch 15-minütiges Erhitzen auf 95 °C dehybridisiert wurden. Die Konzentration der freigesetzten Oligonukleotide wurde mit einem Fluoreszenzspektrophotometer (Perkin Elmer Spectrofluorimeter LS 55, Singapur) mit Anregungs- und Emissionswellenlängen bei 485 bzw. 528 nm und Interpolation aus einer linearen Standardkalibrierungskurve (Abb. 2) bestimmt, die zwischen der Fluoreszenzintensität aufgetragen wurde vs. unterschiedliche FAM-Signal-DNA-Konzentrationen (von 0,5 bis 2 fmol/µL). Bemerkenswerterweise wurde die aus den funktionalisierten AuNPs dehybridisierte FAM-Signal-DNA vor der Analyse 1:400 (in PBS) verdünnt. Die durchschnittliche Anzahl der pro AuNP gebundenen Signal-DNA-Moleküle wurde durch Division der molaren Signal-DNA-Konzentration durch die AuNP-Konzentration in den funktionalisierten AuNPs bestimmt.

Funktionalisierte AuNPs wurden durch Überwachung einer Verschiebung des maximalen Absorptionspeaks17 mittels UV-Vis-Spektroskopie charakterisiert. Um die Konjugation von „Kaninchen-Anti-LAM+Anti-MPT-64“-pAbs mit AuNPs in den funktionalisierten AuNPs zu validieren, wurde ein indirekter ELISA eingesetzt23. Um die Kopplung der Signal-DNA an die funktionalisierten AuNPs zu bestätigen, wurde außerdem eine PCR unter Verwendung von Vorwärts- (5′-CTGCGACGATCTACCAT-3′) und Rückwärtsprimern (5′-GCTTGTCTCGTA AGTTGA-3′)23 eingesetzt.

Das Vorhandensein spezifischer funktioneller Gruppen in AuNPs, AuNPs+Detektionsantikörpern und funktionalisierten AuNPs (konjugiert mit Detektionsantikörpern/Oligonukleotiden) wurde auch durch Aufnahme der FTIR-Spektren mit dem Varian 7000 FTIR-Spektrometer zwischen 650 und 4000 cm−132 bestätigt. Darüber hinaus wurde die Oberflächenkartierung von AuNPs, AuNPs+Detektionsantikörpern und funktionalisierten AuNPs mittels AFM (WITec Instrument, GmbH, Deutschland) durchgeführt, wobei die Proben durch Auftropfen auf ein Glimmersubstrat und Trocknen bei 37 °C32 vorbereitet wurden.

Die Aktivierung von MBs durch Sulfo-SMCC und die Antikörperreduktion durch DTT wurden gleichzeitig wie zuvor beschrieben durchgeführt17. Später wurden MBs in 500 μl PBS resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C aufbewahrt. Die Kopplung von Fängerantikörpern mit MBs wurde durch Aufnahme von ODs bei 270 nm und 405 nm mit UV-Vis-Spektroskopie bzw. Magneto-ELISA bestätigt15,17.

Zunächst wurden die LODs des gereinigten LAM+MPT-64 durch MB-AuNP-I-PCR, SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR und Magneto-ELISA bestimmt. Zu diesem Zweck wurden für die MB-AuNP-I-PCR serielle Zehnfachverdünnungen des Antigens (von 1 µg/ml bis 10 Ag/ml in PBS) hergestellt, wobei der Bereich (die Bereiche) 10 ng/ml bis 100 fg/ betrug. ml und 1 µg/ml bis 1 pg/ml für SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR bzw. Magneto-ELISA. Anschließend wurden 50 µL MBs, gekoppelt mit Meerschweinchen-Anti-Mtb-pAbs (1:1000), in Eppendorf-Röhrchen entnommen, anschließend mit „Waschpuffer“ (unter Verwendung eines externen Magnetfelds) gewaschen und 200 µL Blockierungspuffer (5) hinzugefügt % BSA in PBS). Nach gründlichem Waschen wurden 50 µL verschiedener Verdünnungsmittel des gereinigten LAM+MPT-64 oder optimal verdünnte Urin-EVs (mit 200 µg/ml Protein) von GUTB-Patienten/Nicht-TB-Kontrollen hinzugefügt. Alle klinischen Proben wurden dreifach für die MB-AuNP-I-PCR (und den entsprechenden Magneto-ELISA) und doppelt für die SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR (und den entsprechenden Magneto-ELISA) getestet. Reaktionsmischungen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln inkubiert, um ein Absetzen von MBs zu verhindern. MBs wurden gründlich mit „Waschpuffer“ gewaschen und 50 µL funktionalisierte AuNPs wurden hinzugefügt. Die Reaktionsgemische wurden erneut 1 Stunde lang unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend gewaschen, in 100 µl destilliertem Wasser resuspendiert und 15 Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde ein externes Magnetfeld angelegt und 10 µL Überstand entnommen, um die freigesetzte Signal-DNA mittels PCR17 zu bewerten.

Bei der MB-AuNP-RT-I-PCR waren alle Schritte dieselben wie bei der MB-AuNP-I-PCR, außer dass am Terminalende Echtzeit-PCR (anstelle von PCR) und USB® VerQuest™ SYBR® Green eingesetzt wurden qPCR Mastermix wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers5 verwendet. Darüber hinaus wurden eine Hintergrundkontrolle und eine Negativkontrolle (NC) einbezogen, die alle Komponenten außer „keine Reporter-DNA“ bzw. „kein LAM+MPT-64“ enthielten. Die übrigen Schritte waren dieselben wie in einer früheren Studie5 beschrieben. Für Magneto-ELISA waren alle ersten Schritte wie bei der MB-AuNP-I-PCR, aber statt funktionalisierter AuNPs wurden „Kaninchen-Anti-LAM (1:500)+Anti-MPT-64 (1:1000)“-pAbs und Ziege hinzugefügt Anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase (1:1000) wurden nach gründlichem Waschen bei jedem Schritt unter Verwendung eines externen Magnetfelds nacheinander zugegeben. Später wurden alle Schritte befolgt, wie in einem früheren Artikel17 beschrieben.

Um den Probenmatrixeffekt durch MB-AuNP-I-PCR, MB-AuNP-RT-I-PCR, I-PCR und Magneto-ELISA zu bestimmen, wurden Urin-EVs von gesunden Personen in verschiedenen Verdünnungen vorab auf die Abwesenheit von LAM/ getestet. MPT-64 wurde mit gereinigtem LAM+MPT-64 (1 μg/ml) versetzt und die LODs wurden durch die Herstellung zehnfacher Reihenverdünnungen davon bestimmt15,16.

Die mittlere OD der klinischen Proben aus der Kontrollgruppe+2SD wurde als Cutoff-Wert für positive GUTB-Fälle durch Magneto-ELISA17 verwendet, wohingegen LOD für LAM+MPT-64 durch MB-AuNP-RT-I-PCR durch NC+ berechnet wurde 3SD5. Unterdessen zeigt das Vorhandensein oder Fehlen einer spezifischen Bande das Vorhandensein/Fehlen von Antigen für I-PCR (470 bp) und MB-AuNP-I-PCR (76 bp) an14,15. Sensitivität und Spezifität von MB-AuNP-I-PCR, I-PCR und Magneto-ELISA wurden mit 95 % KI gegen CRS als Referenzstandard5 bestimmt. Der Vergleich von MB-AuNP-I-PCR vs. I-PCR/Magneto-ELISA wurde mithilfe des exakten Symmetrietests durchgeführt, während Vergleiche der ODs zwischen den verschiedenen Gruppen mithilfe des 2-Proben-t-Tests mit gleichen Varianzen durchgeführt wurden15. Für die Analysen wurde die Statistiksoftware STATA/SE Version 14.2 eingesetzt. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in den Zusatzinformationsdateien enthalten.

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Referenzen herunterladen

PKM und BD danken dem Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Neu-Delhi, für die Vergabe des Emeritus Scientist and Research Associate Fellowship, während EK dem CSIR für die Vergabe des Junior/Senior Research Fellowship dankt. AR dankt dem Indian Council of Medical Research, Neu-Delhi, für die Verleihung des Senior Research Fellowship. Wir danken Meenakshi Chauhan und Devendra S Pawar, UHS, Rohtak für die Bereitstellung klinischer Proben von GUTB-Patienten und Nicht-TB-Kontrollen.

Zentrum für Biotechnologie, Maharshi Dayanand University, Rohtak, 124001, Indien

Ekta Kamra, Bhawna Dahiya, Aishwarya Soni und Promod K. Mehta

Spezialzentrum für Nanowissenschaften und Forschungseinrichtung für fortgeschrittene Instrumente, Jawaharlal Nehru University, Neu-Delhi, 110067, Indien

Tulika Prasad & Anam Rais

Abteilung für Statistik, Ramanujan College, Universität Delhi, Neu-Delhi, 110019, Indien

Abhishek Sheoran

Abteilung für Biotechnologie, Deenbandhu Chhotu Ram University of Science and Technology, Murthal, Sonipat, 131039, Indien

Aishwarya Soni

Abteilung für Mikrobiologie, Universität für Gesundheitswissenschaften (UHS), Rohtak, 124001, Indien

Suman Sharma

Abteilung für Mikrobiologie, Fakultät für Alliierte Gesundheitswissenschaften, SGT University, Gurgaon, 122505, Indien

Befördert K. Mehta

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EK, PKM und TP führten den Großteil der Experimente durch und beteiligten sich an der Datenanalyse und der Erstellung des Manuskripts. AR, BD, Ai.S. und SS führte einige Experimente durch. TP, Ab.S., EK, AR und PKM beteiligten sich an der Datenanalyse. PKM konzipierte die Studie und entwarf die Experimente, während EK und PKM den endgültigen Entwurf des Manuskripts vorbereiteten. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen, an der Bearbeitung des Manuskripts mitgewirkt und die endgültige Fassung des Manuskripts genehmigt.

Korrespondenz mit Promod K. Mehta.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kamra, E., Prasad, T., Rais, A. et al. Diagnose von Urogenitaltuberkulose: Nachweis von mykobakteriellen Lipoarabinomannan- und MPT-64-Biomarkern in extrazellulären Urinvesikeln durch einen nanobasierten Immuno-PCR-Assay. Sci Rep 13, 11560 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38740-3

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Eingegangen: 29. März 2023

Angenommen: 13. Juli 2023

Veröffentlicht: 18. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38740-3

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